Zakład Embriologii Doświadczalnej

OSIĄGNIĘCIA NAUKOWE Zakładu Embriologii Doświadczalnej

1. Uzyskanie, po raz pierwszy w świecie, królików wywodzących się z trzeciej generacji seryjnie klonowanych – metodą transplantacji jąder komórkowych – zarodków 8-komórkowych. (Piotrowska i wsp., 2000 – Biology of Reproduction 63, 677-682)

2. Uzyskanie myszy po transferze jąder blastomerów zarodków 8-, 16- komórkowych do enukleowanych zygot. Zygoty enukleowano oryginalną metodą opracowaną w Zakładzie (SE - enukleacja selektywna), w której usuwana jest tylko otoczka jądrowa przedjądrzy wraz z przytwierdzoną do niej chromatyną, a płynna zawartość przedjądrzy wraz z pseudojąderkami pozostawiona zostaje w cytoplazmie (Gręda, Karasiewicz, Modliński, 2006 – Reproduction132, 741-748; Gręda, Modliński, Piliszek, 2015 - Animal Science Paper and Reports 33(4): 323-336). Urodzone myszy są pierwszymi ssakami otrzymanymi po transferze do enukleowanych zygot jąder pochodzących z zarodków starszych niż zarodki 2-komórkowe.

3.  Uzyskanie urodzonych prosiąt po transferze jąder fibroblastów do SE zygot świni we wczesnym okresie rozwoju przedjądrzy (wniosek patentowy PL403655-A1; badania we współpracy z IZ PIB w Balicach)

4. Uzyskanie, po raz pierwszy, pełnego rozwoju przedimplantacyjnego zarodków myszy (23% blastocyst) po transferze jąder zarodkowych do selektywnie  enukleowanych niedojrzałych oocytów w stadium pęcherzyka zarodkowego. Wykazano, że warunkiem pomyślnego rozwoju rekonstruowanych oocytów jest obecność – w czasie ich dojrzewania in vitro – otaczających je komórek pęcherzykowych. Stwierdzono również , że pozostawiony w cytoplazmie podczas selektywnej enukleacji materiał jąderkowy pęcherzyka zarodkowego pełni istotną rolę w prawidłowym uformowaniu jąder rekonstruowanych oocytów i rozwijających się z nich zarodków [Mohammed, Karasiewicz i Modliński, 2008 – Molecular Reproduction and Development 75, 1269-1280].

5. Uzyskanie, po raz pierwszy, urodzonych chimer zarodkowo-somatycznych myszy i owcy, w wyniku wprowadzenia fibroblastów płodowych do bruzdkujących zarodków.
   Wykazano, że w przypadku myszy, część wprowadzonych komórek somatycznych podlega fuzji z komórkami biorcy i może przetrwać (jako komórki hybrydowe) w tkankach pochodzących ze wszystkich trzech listków zarodkowych. [Piliszek i wsp., Reproduction – 2007, 133, 207-218]. Wykazano także, że przeprogramowanie wprowadzonych komórek somatycznych zachodzić może również pod wpływem środowiska zarodkowego (Żyżyńska – Galeńska, praca doktorska, 2014). Przeprogramowanie wprowadzonych komórek w środowisku zarodków chimerowych zostało potwierdzone analizą markerów molekularnych, która wykazała, że wprowadzone komórki somatyczne wykazują ekspresję genów odpowiedzialnych za pluripotencję. Obecność wprowadzonych do zarodka komórek somatycznych stwierdzono również, z zastosowaniem metody RAPD, w tkankach urodzonych chimerowych jagniąt [Karasiewicz i wsp., 2008 – International Journal of Developmental Biology 52, 315-322].

6. Uzyskanie międzygatunkowych zarodków hybrydowych po wprowadzeniu jąder fibroblastów skóry nornicy rudej (Myodes glareolus) do nieenukleowanych oocytów M II oraz zygot myszy (Mus musculus), a także do zygot, z których metoda selektywnej enukleacji usunięto jedno z przedjądrzy. W czasie I podziału bruzdkowania wyróżnicowane chromosomy jąder komórki biorcy oraz jader fibroblastów tworzą, w zależności od wariantu doświadczenia wspólne diploidalne (2n = 48; mysz n=20, nornica n = 28) lub triploidalne (3n = 76; mysz n = 20 ; nornica 2n = 56) płytki metafazowe. Około 35% takich zarodków hybrydowych rozwijało się do stadium blastocysty (Lencka-Ostrowska, Modlinski, - 2008, Biology of Reproduction 78, Suppl. 1: 123)

7. Uzyskanie, w wyniku międzygatunkowego klonowania somatycznego, pełnego rozwoju przedimplantacyjnego selektywnie enukleowanych zygot bydlęcych po ich rekonstrukcji jądrami fibroblastów skóry żubra (Loi, Modlinski , Ptak, - 2011, Theriogenology 76(2):217-28)

8. Opracowano wysoce wydajny wariant kriokonserwacji oocytów i wczesnych zarodków bydła metodą witryfikacji [Papis i wsp.,2000 – Theriogenology 54, 651-658]. Wariant ten uzyskał w 2000 roku ochronę patentową w Japonii (patent nr. 3044323).

9. Wykazanie korzystnego wpływu dodatku melatoniny do pożywek hodowlanych na efekty rozwoju in vitro zarodków bydła (Papis i wsp., 2007 – Journal of Pineal Research 43, 321-326).

10. Wykazano, że szybkość transferu zarówno blastocyst, jak i bruzdkujących zarodków zarodków myszy wpływa wyraźnie na żywotność blastocyst oraz na przedimplantacyjny rozwój zarodków. W bruzdkujących zarodkach oraz w blastocystach wprowadzanych metodą szybkiego transferu ( szybkość > 1m/sek.) obserwowano znacznie większą liczbę zmian morfologicznych i anomalii rozwojowych niż w zarodkach i blastocystach wprowadzanych metodą wolnego transferu (szybkość < 1m/sek.). Ponadto w blastocystach po szybkim transferze stwierdzono wyższy indeks apoptotyczny niż w blastocystach po wolnym transferze (Grygoruk, Sieczyński Modliński i wsp., - 2011, Fertility and Sterility95(4):1458-61. ; Grygoruk, Pietrewicz, Modliński i wsp., - 2012, Fertility and Sterility 97(6):1417-21).

11. Wykazano, że biopsja blastomerów (BB) 8-komórkowego zarodka myszy wywiera długofalowy wpływ na postnatalny rozwój oraz zachowanie potomstwa myszy uzyskanego z zarodków BB. Sugeruje to, że procedury GPD (Prenatal Genetic Diagnosis) mogą być obarczone poważnym ryzykiem pojawienia się w późniejszym okresie rozwojowym zaburzeń zarówno metabolicznych, jak i neurologicznych (Sampino i wsp., 2014 – Human Reproduction 29(9), 1875-1883).

12. Wykazanie, ze zaawansowany wiek rodziców (APA - Advanced Paternal Age)zwiększać może ryzyko wystąpienia zespołu zaburzeń autystycznych (ASD – autism spectrum disorder). Do analizy wpływu APA na cechy zachowań związanych z autyzmem ( social deficits, communication impairments and stereotypic/repetitive behaviors) wykorzystano model mysi. Stwierdzono, że potomstwa APA wykazuje wyraźne symptomy ASD - zarówno pokolenie F1, jak i pokolenie F2 po starych dziadkach wykazywało , między innymi, wzrost wokalizacji (USV – ultrasound vocalization), wyraźne obniżenie zachowań socjalnych oraz wzrost zachowań lękowych. Sugerujemy, że ryzyko wystąpienia ASD może przenosić się na następne pokolenia jako efekt dziedzicznych mutacji i/lub zmian epigenetycznych związanych z APA. (Sampino i wsp., 2014- Translational Psychiatry4:e386. doi: 10.1038/tp.2014.27.

Zakład Embriologii Doświadczalnej prowadzi od wielu lat współpracę naukową z Uniwersytetem w Teramo (Włochy) z zespołami prof. Grażyny E. Ptak i prof. Pasqualino Loi Osiagnięciami naukowymi tej współpracy są:

1. Wykazanie, że diapauza zarodkowa (ED) może być indukowana u zarodków gatunków ssaków (owca, królik, bydło), u których to zjawisko normalnie nie występuje. Sugeruje to, ze ED jest zjawiskiem filogenetycznie konserwatywnym zachowanym u wszystkich gatunków ssaków, również u człowieka i stawia pod znakiem zapytania słuszność obowiązującej obecnie teorii niezależnej ewolucji ED u różnych gatunków ssaków [Ptak i wsp., 2012 – PloSOne 7(3): e33027.doi:10.1371/journal.pone.0033027.] Badania te mogą mieć duże znaczenie dla medycyny rzucając nowe światło na analizę przebiegu ciąży u człowieka ( Ptak, Modliński , Loi, 2013 - Reproductive Biology and Endocrinology 11:92).

 

2. Wykazanie, że po liofilizacji, w ok. 60% limfocytów owcy genom pozostaje nieuszkodzony, zaś u 40% dochodzi do przypadkowych uszkodzeń. Jednakże, po wprowadzeniu liofilizowanych jąder do enukleowanych oocytów owcy uszkodzenia te są naprawiane przez czynniki działające w cytoplazmie oocytu (DNA repairing activity) i wprowadzone jądra wykazują prawidłowe kompetencje rozwojowe. Zarodki uzyskane po rekonstrukcji enukleowanych oocytów liofilizowanymi jądrami były prawidłowe zarówno pod względem kariologicznym, jak i morfologicznym i nie różniły się od zarodków uzyskanych po rekonstrukcji oocytów jądrami komórek nie liofilizowanych. Wyniki te potwierdzają użyteczność liofilizacji komórek somatycznych jako skutecznej procedury przechowywania komórek ssaków, które użyte miałyby być w przyszłości do SCNT (Iuso i wsp., 2013 - PLoS One. 2013;8(1):e51317. doi: 10.1371/journal.pone.0051317).

 

3. Wykazanie, na modelu owczym, że niektóre techniki wspomaganego rozrodu (ART - Assisted Reproductive Technogies) wpływać mogą na waskulogenezę zarówno w łożyskach, jak i w rozwijających się płodach. Analiza rozwoju zarodków owczych uzyskanych in vitro (IVP – In Vitro Production) wykazała, ze po ich przeszczepieniu do biorczyń, dochodziło w wielu przypadkach do zahamowania ich rozwoju pomiędzy 20-30 dniem ciąży, a więc w okresie, kiedy tworzy się układ krążenia. W płodach powstałych po IVP stwierdzono niedorozwój układu krążenia, a u większości martwych płodów (71%) zaobserwowano wybroczyny krwi w osierdziu i łożysku. Wprawdzie u rozwijających się płodów początkowy niedorozwój krążenia ulega stopniowej poprawie, tym niemniej pomiędzy 26-30 dniem ciąży obserwuje się ciągle w łożyskach zarówno mniejszą liczbę naczyń krwionośnych, jak i ich mniejszą średnicę. Prowadzić to może do niedożywienia płodu (w efekcie do ograniczenia jego wzrostu) co może mieć długofalowe konsekwencje zdrowotne (m.in. schorzenia układu sercowo - naczyniowego) na rozwój urodzonych zwierząt (Fidanza i wsp., 2014 – Biology of Reproduction, 91(1):21, 1–7 : DOI 10.1095/biolreprod.113.113902

 

 

4. Wykazanie, na podstawie badania łożysk płodów rozwijających się z androgenetycznych i partenogenetycznych zarodków owcy, ze typ samoistnego obumieranie komórek (cellular self- dectruction) w łożysku tych płodów jest zależny od matczynego lub ojcowskiego genomu. W łożyskach płodów rozwijających się z zarodków androgenetycznych (mających genom wyłącznie pochodzenia ojcowskiego) dominującą formą obumierania komórek jest autofagia, natomiast w łożyskach płodów pochodzących z zarodków partenogenetycznych (posiadających jedynie genom matczyny) samoistne obumieranie komórek zachodzi głównie na drodze apoptozy. (Ptak i wsp., 2014 – Open Biology 4: 140027. http://dx.doi.org/ 10.1098/rsob.140027 )

 

Zakład Embriologii Doświadczalnej prowadzi również od wielu lat współpracę naukową z Uniwersytetem w Manchesterze z zespołem dr Bereniki Płusy (Department of Life Sciences) Osiagnięciami naukowymi tej współpracy są:

1. Wykazanie różnic w plastyczności komórek węzła zarodkowego blastocysty myszy i możliwości przeprogramowania komórek endodermy pierwotnej w komórki linii epiblastu; W badaniach z użyciem zarodków chimerowych wykazano, że komórki poszczególnych linii w zarodku przedimplantacyjnym mogą ulec przeprogramowaniu w komórki innych linii, a ostateczne różnicowanie zachodzi dopiero po implantacji zarodka. [Grabarek i wsp., 2012 - Development 139(1), 129-139.]

1. Poznanie molekularnych mechanizmów odpowiedzialnych za różnicowanie w przedimplantacyjnych zarodkach mysich oraz analizy porównawcze innych gatunków ssaków [Piliszek i wsp., 2016 - Mol. Hum. Reprod. doi: 10.1093/molehr/gaw002 ]

 

Z Zakładem Embriologii Doświadczalnej związane jest Laboratorium Mikroskopii Konfokalnej i Fluorescencyjnej (kierownik – dr Anna Piliszek)

 

Laboratorium dysponuje sprzętem umożliwiającym wykrywanie i obrazowanie cząsteczek fluorescencyjnych w preparatach mikroskopowych, w tym obserwacje przyżyciowe oraz obrazowanie konfokalne.

 

Aparatura badawcza

1. Mikroskop konfokalny Nikon A1R (obiektywy 10x, 20x, 40x, 60x; lasery 405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm; skaner hybrydowy, skaner rezonansowy, kontrast Nomarskiego i kontrast Hoffmana, lampa UV i filtry do epifluorescencji, komora klimatyczna OKO lab.)

2. Mikroskop epifluorescencyjny Nikon Optiphot 2 (obiektywy 10x, 20x, 40x, 60x, 100x, lampa UV i filtry do epifluorescencji)

3. Mikroskop stereoskopowy epifluorescencyjny Nikon SMZ 18

Mikroskopy wyposażone są w kamery cyfrowe do rejestracji obrazu i oprogramowanie NIS Elements do rejestracji i analizy obrazu.